DFTC2023发酵工艺分享大会咨询

微言：15829889297

王煜：18829263008

内毒素带有负电荷, 由于脂多糖结构中类脂 A 的疏水性, 使得内毒素倾向于以高分子聚合物的状态存在而难溶于水, 并由于环境中 Ca2+、Mg2+等被吸引到带负电荷的脂多糖上而得以稳定。通常其分子量几十万至上千万道尔顿。

1.2 内毒素存在形式

（1）单体，（2）胶束，（3）囊状

基因工程蛋白通常采用细菌、酵母、哺乳动物细胞或昆虫细胞作为宿主进行大规模发酵生产, 但大多是以大肠菌作为表达系统。以大肠杆菌作为表达系统的蛋白通常都是在胞内表达, 在纯化蛋白之前必须通过高压匀浆、超声波破碎或低压渗透等方法将菌种破壁, 以释放蛋白。同时细胞壁内的脂多糖也大量释放到缓冲液中, 通常 10% 的湿菌浓度可产生几万EU/mL 的内毒素, 这是内毒素的主要来源。

在生产过程中如何防止内毒素污染

DFTC2023发酵工艺大会 赠送资料包括：

1. 线下会议名额若干；

2. 《工业发酵实战技术手册》；

3. 发酵大师网下载用金币；

4. 各种实验用原料样品；

5. 会议相关高清视频回放、专家PPT、普适性的SOP、工作方法、文档资料、电子资源等

由于内毒素显著的危害性，FDA等法规也对内毒素的控制和将其降低到安全水平提出明确要求。无菌操作和操作区洁净度也是控制外源性内毒素污染的有效手段。然而对于样品本身就存在的内源性内毒素污染，即使外源性内毒素得到有效控制，最终工艺制备的样品也存在内毒素超标的风险。那么就需要从样品本身制备工艺角度，结合内毒素特点，寻找有效方法，使样品本身内毒素(Endotoxin)降低，达到工艺要求，提高产品安全性。

② 离子交换法 对于阴离子交换层析，内毒素在 pH>2时带负电荷，与阴离子交换介质Q或DEAE有较强结合, 可使用目标蛋白从阴离子交换填料流穿的方式去除内毒素；也可在目标蛋白和内毒素同时结合于层析介质上后，由于内毒素的结合能力较蛋白的结合能力强，因此可先将目标蛋白洗脱出来，然后再用高盐缓冲液或NaOH将内毒素洗出。对于阳离子交换层析，在pH4.0时，内毒素还是带有负电荷不能和填料结合而随流动相流出层析柱，目标蛋白则可以与阳离子交换介质结合，因此采用阳离子交换层析也可以很好的去除内毒素。此外，采用一些表面活性剂比如Triton X-114，既能阻止内毒素结合在阴离子柱上也可阻止内毒素结合在阳离子柱上。

DFTC2023赠品之《发酵实战技术手册》

③ 凝胶过滤层析 内毒素可在水溶液中以非极性和离子相互作用，形成大小为 1,000 kDa 分子聚集体，它与多数生物蛋白分子量差异较大，基于这一特征，可以采用凝胶过滤层析，将大分子内毒素分子与目标蛋白分离。但其处理量小, 处理时间较长。

④ TFF切向流技术去除内毒素 内毒素在不同的水溶液中，常形成聚集体结构，因其聚集的程度不同，分子大小不一。小聚集体分子量为10~20 kDa，而大聚集体的分子量可达1000 kDa。使用切向流膜孔径小于内毒素的分子量而使内毒素分子截留，目标样品透过膜孔，达到去除样品中内毒素的目的。影响蛋白溶液中内毒素去除因素主要包括，目标分子的大小分布、内毒素与目标分子的相互作用、目标蛋白质浓度以及是否添加相应的洗涤剂。

⑤ 通过亲合层析去除内毒素 亲合层析技术, 特别是免疫吸附剂在生产中的运用使得生物大分子的纯化变得简单。免疫吸附的原理基于抗原、抗体的特异性作用, 以目标蛋白作为抗原, 将通过杂交瘤技术生产的单克隆抗体偶联于介质上, 以此介质来吸附目标蛋白。由于相互作用的高度特异性, 理论上仅有目标蛋白吸附于介质上, 内毒素全部穿透, 洗脱后将得到纯度很高的无热原产品。实际上, 由于介质本身存在的非特异性吸附, 仍有少量的杂蛋白和内毒素同时被吸附, 但内毒素含量是极低的。在干扰素(IFN)生产中, 洗脱物内毒素含量一般为0.25EU/mL。