发酵后处理:蛋白纯化过程中沉淀的形成原因及解决方法

来源:世展网 分类:生物行业资讯 2023-06-07 10:02 阅读:*****
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在进行蛋白纯化时,往往会遇到蛋白在纯化过程中出现沉淀的现象,对于蛋白纯化新手来讲,遇到此类问题,往往会不知所措。本文针对蛋白纯化过程出现沉淀的可能原因及解决方法做一简要的介绍。 

1蛋白出现沉淀可能原因① 金属离子导致的蛋白沉淀:这种现象经常会出现在使用金属螯合层析纯化组氨酸标签(His tag)蛋白的过程中,填料上有部分Ni2+(或其它金属离子)会脱落,脱落的金属离子会导致蛋白产生凝集和团聚,进而形成沉淀。② 蛋白处在其等电点的溶液中:如果溶液环境的pH值在蛋白质等电点的附近,由于蛋白质在等电点时净电荷为零,减少了分子间的静电斥力,因而容易发生相互吸引聚集形成沉淀,这也是为什么蛋白在等电点时的溶解度最小的原因。③ 蛋白反复冻溶:在冻融过程中生成的一些小冰晶会对这个蛋白的结构造成一定的伤害,并且其周围的离子和缓冲液状态也会发生较大的变化,造成蛋白沉淀。④ 长时间放在4℃或更高的温度:在4℃或更高的温度之下放置蛋白质,容易滋生微生物,微生物的生长会造成蛋白的性质变化,或者微生物将蛋白降解也会产生一些聚集沉淀 。

⑤ 遭到剧烈的物理的或化学的作用:如高温,高压,高剪切力,强酸,强碱等,此时蛋白分子中的次级键遭到破坏断裂,导致空间构象从紧密有序的变为松散无序的状态,蛋白发生不可逆变性形成沉淀 。

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2 此外蛋白形成沉淀的原因经常与以下原因有关A 蛋白的性质:在表达含有二硫键的蛋白时,由于二硫键容易形成错配,特别容易形成包涵体蛋白。所以蛋白的氨基酸序列中含有较多半胱氨酸时容易形成沉淀。此外,蛋白结构中脯氨酸的含量增多也容易形成沉淀,膜蛋白及一些疏水性强的蛋白就很容易发生疏水聚集而沉淀。B pH:蛋白质一般会在高pH时呈现溶解性提高,在低pH时容易形成沉淀的现象,推测这种现象可能与氢键的形成有关。C 盐浓度:也就是经常所说的盐析效应,高浓度的盐会破坏蛋白周围的水化膜,使得蛋白质聚集沉淀。比如在纯化蛋白时,通常可以使用饱和的硫酸铵溶液对蛋白进行沉淀。盐析沉淀通常不会破坏蛋白质的高级结构,蛋白复溶时活性可以完全恢复。最常见的例子为使用硫酸铵沉淀纯化IgG。但是硫酸铵沉淀也常常碰到蛋白不可逆复溶的情况,例如经常会遇到大肠杆菌(E.coli)表达的重组蛋白在硫酸铵沉淀后很难再复溶的情况,使用盐析的方法可能与蛋白本身的性质也有关系,建议使用该方法时先进行小试验证。D 有机溶剂:如丙酮沉淀等,但有机溶剂并不是全部对蛋白起沉淀作用,有时候也会起到助溶的作用,例如有些膜蛋白需要用有机溶剂抽提。E 表面活性剂: 表面活性剂一般对蛋白质起到助溶的作用,经常使用的表面活性剂还有Tween,Triton,Span等。F 还原剂:还原剂(如DTT,β-巯基乙醇,TCEP等)往往对蛋白质有助溶作用,尤其对一些含有二硫键的蛋白,其还原剂的加入可以大大减少蛋白的沉淀。有些蛋白虽然加入了还原剂,但由于还原剂在空气中慢慢氧化,会形成沉淀析出。

G 变性剂:例如在做SDS-PAGE电泳时,加入SDS可以将沉淀的蛋白进行溶解,此外,尿素、盐酸胍也可用于沉淀蛋白的再溶解,如在纯化包涵体蛋白时,使用8M尿素或6M盐酸胍可以使包涵体溶解。但应注意的是在用变性剂将蛋白溶解后,去除变性剂时经常会出现蛋白的再次沉淀现象。

DFTC2023赠品之《发酵实战技术手册》3 纯化蛋白时如何避免沉淀的发生在使用Ni柱纯化蛋白的时候,向纯化之后的蛋白溶液当中适当的加入少量的EDTA(如1~5mM),让EDTA螯合脱落的Ni2+离子,防止重金属导致蛋白沉淀。 适当加入分散剂,避免蛋白质分子接触碰撞,减少它的聚集,比如甘油,聚乙二醇,甘露醇,山梨醇等。 加入保护蛋白,如果纯化的蛋白允许加入一些辅助性的保护蛋白,可适当添加,如向蛋白中加入白蛋白,BSA等。 可以加入适量的保护氨基酸,比如说精氨酸。 准确地算出或测定出蛋白质的等电点(pI),避免使用的溶液pH值处在等电点附近。 有些蛋白比较娇贵,针对这些蛋白的纯化过程要避免蛋白的热损伤,常常需要在低温的条件下进行纯化或者其它操作。同时对耐高温的蛋白如糖化酶,可以利用此特性来在高温下让其它杂蛋白变性沉淀,目标蛋白活性无影响这一特性来纯化蛋白。

有些特定的蛋白独立的时候是很难存在的,它必须有一些辅助的离子或者辅助的蛋白才能够维持一个很好构象,所以必要的时候添加它的辅助的蛋白或者辅因子。

 总而言之,在蛋白纯化及制备过程中,尽量选择温和的操作环境,纯化过程要缓慢,避免剧烈操作。遇到困难时,多观察现象,多角度寻找原因,尝试多种纯化方法,定能找到一个完美的解决方案。

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