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人们运用基因工程技术已在大肠杆菌中成功地表达了许多重要的生物活性蛋白基因但不同外源蛋白基因在大肠杆菌中的表达效率差异很大。本文综述了影响外源基因表达效率的一些常见因素, 特别是对影响翻译起始的因素给予了更多的关注, 同时总结了一些提高外源基因在大肠杆菌中表达效率的行之有效的方法。
大肠杆菌由于遗传背景清楚, 可进行大规模发酵培养, 表达周期短, 操作简单及已有大量可供选择利用的载体, 而成为人们克隆与表达外源基因的首选。但在外源基因的表达过程中, 常常会遇到表达效率不高和产率较低等困难。以往的研究表明, 影响外源基因表达效率的因素主要有密码子的选用、目的基因的量、mRNA的稳定性、载体的选择、培养条件的控制、启动子的强度和翻译起始效率等。其中, 翻译起始效率起了非常重要的作用, 而翻译起始效率又主要受一。SD序列、SD序列与起始密码子之间的间距、DB序列以及mRNA翻译起始区(TIR)的二级结构等因素的影响。在蛋白质翻译过程中, tRNA携带相应的氨基酸与核糖体上的A位作用, 如果结合到A位的tRNA与该密码子相对应, 就可进行肽链的合成与延伸。原核生物中,由于不同tRNA含量的差异导致了对不同密码子的偏爱性。相应tRNA丰富的密码子, 正确的氨基酸会很快连接上, 而相应tRNA稀少的密码子, 要经过多次相互辨认才能找到正确tRNA , 进而外源蛋白的合成将停顿。如果相同的稀有密码子连续出现, 就会抑制蛋白质合成,甚至发生密码子错配。通过对E.coli中一些含量丰富的蛋白质的密码子使用情况进行统计后发现AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA和GTC等8种密码子是大肠杆菌的稀有密码子。如果外源基因含有较高比例的稀有密码子, 其表达效率往往不高。
在此情况下, 应针对密码子的偏爱性采取措施，如提高转运稀有密码子相应氨基酸tRNA的浓度或者采用非连续多核苷酸定点突变方法对外源基因中稀有密码子进行同义突变等, 但提高tRNA的浓度可能会影响蛋白质二级结构形成 , 而有人通过改造稀有密码子成功提高了葡萄球菌肠毒素A(SEA蛋白)的表达量。此外, 部分学者通过体内和体外两种表达体系表达大肠杆菌二氢叶酸还原酶基因后发现, 在起始密码子后引入使用频率最高的两个第二密码子AAA和AAU可以有效提高翻译效率 。最近有学者研究发现, 基因密码子使用偏性与蛋白质三级结构间具有密切的相关性。DFTC2023发酵工艺大会特约焦亮老师进行菌种相关主题分享，内容涉及菌种开发、菌库搭建、发酵用微生物菌种制备等相关主题。点击图片，查看分享内容目前已可以购买到种类非常多的质粒, 其中大部分都需要中高量的拷贝数才能使目的基因得到高表达。通常来说, 目的基因的拷贝数越多, 细胞内的产物表达就越快, 其积累也越快, 则产物发生聚集的可能性就越大,也就越容易形成包涵体, 但一般情况下我们需要的常常是可溶性的且有活性的蛋白。因此, 人们更偏爱速度较慢的但比较稳定的表达 , 此时目的基因的大量拷贝就显得没有必要了。如果启动子的强度、mRNA的稳定性和翻译起始的效率等都适宜, 那么少量的基因拷贝也就足够了, 这样目的基因的表达量就完全取决于表达时间的长短了。mRNA的稳定性的稳定性可以影响表达的效率。Carrier和Keaslin研究了许多mRNA 5'端的二级结构以确定其中哪些可以延长其半衰期。但是发现只要转录水平很高,它们对β-半乳糖苷酶的表达基本上没什么影响，而转录水平较低的时候，mRNA 的稳定性越高, 表达量就越高。Lopez等则采用了另外一种办法。他们将RnaseE的C末端截去一部分使其丧失活性, 这样便大大减少了mRNA的降解。这样在启动子T7的启动下, β-半乳糖苷酶的表达量增加了20倍以上，但是有趣的是, 在使用lac启动子的时候, β-半乳糖苷酶的表达量反而降低了。mRNA 3'非翻译区在基因表达调控中的作用也日益受到关注, 它不仅调控mRN的体内稳定性及降解速率, 控制其利用效率, 而且还调控mRNA的翻译时间、位点及产物。表达系统的核心是表达载体。一般来说大肠杆菌表达载体应满足下列条件：① 重组质粒有较高拷贝数且表达量高；② 稳定性高；③ 适用范围广；④ 表达产物容易纯化。目前已知应用较广的大肠杆菌表达载体有非融合表达载体、融合表达载体、带纯化标签表达载体。
1）非融合表达载体：其优越性在于表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋白在结构、功能以及免疫原性等方面基本一致, 从而可以方便地进行后续研究。为提高翻译效率, 人们在设计表达载体时采用了许多办法如：① 优化翻译起始区以达到高效表达；② 构建SD-AUG间隔不等的表达载体以供选择利用；③ 在构建表达载体时, 使用近年来发现的“ 原核翻译增强子”序列, 以提高翻译效率；④ 将“ 原核翻译增强子”和双顺反子结构结合到一起, 从而提高表达效率。
2）融合表达载体：表达融合蛋白的一般模式为：原核启动子-SD序列-起始密码子-原核结构基因片段-目的基因序列-终止密码子。由于翻译起始信号在调控翻译强度中是最重要的, 融合表达载体通常SD-AUG间隔已固定,翻译起始信号组织合理, 有利于翻译起始, 而且简化了蛋白分离纯化工艺。将分子质量较小的蛋白质以融合蛋白形式表达, 可增强及表达产物稳定性并生产出可溶性蛋白。
3）带纯化标签的表达载体：人们设计了一些用于纯化目的蛋白的纯化标签用于表达载体的构建、目前用得较多的纯化标签是GST和6His, 该方法为生产高纯度高活性的基因工程产品创造了有利条件。
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菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子-核酸与蛋白质合成的综合表现, 通常用生长速率来表征控制菌体生长对提高质粒稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率都有重要意义。
1）质粒稳定性与拷贝数的控制：为提高工程菌培养过程中质粒的稳定性, 工程菌的培养常分为：①第一阶段先使菌体生长到一定密度；②第二阶段诱导外源基因的表达。Seo JH研究低比生产速率、质粒拷贝数、目的产物表达量三者关系时发现，第一阶段工程菌中外源基因不表达, 高比生长速率培养使质粒拷贝数下降, 但质粒稳定性明显增加；第二阶段外源基因表达,低比生长速率培养, 使质粒拷贝数增加, 外源基因表达量增加。
2）重组大肠杆菌的培养方式：① 补料分批培养：在分批培养中, 为了获得外源蛋白高表达，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来, 可采用DO-stat、Balanced DO-stat法和控制菌体的低比生长速率μ ；② 连续培养：由于重组菌的不稳定性, 很难进行连续培养，为了解决这一问题, 人们把重组菌的生长阶段和基因表达阶段分开, 进行两阶段连续培养。在这样的系统中关键操作参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率，优化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定, 菌体进入第二阶段后可获得最高表达水平或最大产率；③ 透析培养该法是用物理方法把乙酸从培养基中除去。大量乙酸在透析器中透过半透膜, 降低了培养中乙酸浓度, 从而获得高菌体密度。外源基因在E.coli中的表达水平主要取决于转录和翻译的效率, 通过采用可诱导的强启动子, 在多数情况下真核基因可以得到有效的转录。目前构建的表达载体一般都采用较强的且易于诱导的启动子, 如PL、Lac、Tac和Trp等启动子, 其转录水平都受到较强的调控。 因此，一般在应用表达载体的时候, 在启动子的强度上花费的精力并不是很多, 对实验产生不便的情况也很少发生。虽然这一因素以前常被忽略，但是它却可能对外源基因在大肠杆菌中的表达效率具有非常重大的影响。Siunwns 和 Yansura 通过改变翻译起始效率来减慢翻译速度，保证了大肠杆菌的分泌负荷不致过重，这刚好与直观相反，较高的产物分泌量反而来自于较低效率的核糖体与 mRNA 的结合（翻译起始)。所以说，翻译起始效率往往不是一个或少数几个因素作用的结果，而是多个因素共同作用的结果，随具体问题而定。正如 Sprengart 和 Porter 所说，翻译起始主要受如下因素的影响：
① SD序列：SD 序列位于起始密码子上游5-13个核苷酸处，一般为高含嘌呤(GA) 的5个核苷酸。它与核糖体 16srRNA 的3'端互补配对，使核糖体结合到mRNA上而完成翻译起始，不同启动子的核糖体结合位点可以不同。但SD 序列构成大致相同。rRNA - mRNA 的互补区域越长, 基因翻译的概率就越大。它是选择准确的翻译起始位点的主要决定者。因为SD序列与16srRNA之间的作用, 在没有起始tRNA和起始因子存在的情况下, mRNA依然能够有效地与小亚基结合。由于绝大多数细菌mRNA都有SD序列, 人们就假设了原核生物的翻译起始是由与序列的碱基配对开始的, 然后才是起始密码子与起始tRNA之间的作用 , 但也有研究表明, 核糖体小亚基先与起始tRNA结合再与mRNA翻译起始位点结合也是可能的。最近有学者对30个原核基因的SD序列与表达水平、启动子类型和编码的基因之间的距离的相关性进行分析后发现, 它们之间关系密切。高表达的基因一般具有很强的SD序列, 而普通基因则不然。起始密码子是AUG的基因比起那些以GUG或UUG为起始密码子的基因更有可能具有SD序列。
② SD序列与起始密码子之间的间距：人们发现SD区域到起始密码子的距离可在5~13个碱基范围内变化, 但它与基因表达水平的关系尚不太清楚。有人认为外源基因的起始密码子与SD系列之间最适距离为4~10个核苷酸, 还有报道以5个碱基为最佳 , 国内也有学者采用的是5个碱基，也有学者认为, ATG与SD序列间相距7~8个核苷酸为最适, 他们所构建的pSBHL-3和pSBHL-11表达质粒中, ATG与SD序列之间相距均为7个核苷酸，而构建的pSBHL-2中为10个核昔酸, 转化大肠杆茵后, 除pSBHL-2外都能高效表达hIL-3。以上结果说明SD与ATG之间的距离适当能更有效地促进翻译的效率。国外已有学者将SD序列、起始密码子以及SD序列与起始密码子之间的间距三者的关系建成了数学模型以便更好地研究它们。点击图片，查看目录
③ Downstream Box(DB)：DB可能在许多原核mRNA中有功能性作用。DB最初被认为是一个翻译增强元件, 大约由8~13个核苷酸组成, 位于起始密码子的下游, 与16srRNA的1469~1483核苷酸(AntiDownstream Box，ADB）互补, 并常常存在于许多高表达的E.coli和噬菌体mRNA起始密码子的下游。有报道在SD存在的时候, DB可以促进T7基因的翻译。DB可与SD对翻译起始起协同增强作用，但在没有SD序列存在的时候, DB需要长达12~13个碱基来促进高效表达, 而只有8~11个碱基且中间有间断的时候活性就大大降低了。但又有报道, 起始密码子下游根本就没有DB, 其存在的证据仍不明显。而有学者在研究一个与SD类似的序列在介导柯萨奇病毒B3的RNA的翻译起始的过程中发现, 不管是对DB区的碱基进行敲除或替换, 都能显著影响翻译起始的效率。④ mRNA翻译起始区的二级结构影响：外源基因在大肠杆菌中表达的另一个因素是mRNA翻译起始区(TIR)的二级结构, TIR指mRNA起始密码子前后数十个核苷酸一切与翻译起始有关的顺式序列, 包括RBS及其它参与二级结构形式并影响翻译的序列。mRNA TIR由载体一部分和外源基因5'端的转录本共同组成, 任何一部分的核苷酸改变都可导致相应mRNA TIR结构的改变。一般认为，TIR存在稳定的二级结构对翻译不利, 降低TIR二级结构稳定性可以提高翻译起始效率来增加mRNA稳定性，则有利于外源基因表达。Cpleman构建了一个突变体, 其SD序列和ATG以及二者间序列处于单链状态, 因一较稳定循环结构在5'端仅隔SD序列2个核苷酸, 翻译不能有效进行。而颈环结构在起始密码子3'端也可能降低翻译起始效率。因此只有整个TIR结构都处在单链状态, 或完全处于开放的线形结构才最有利于翻译起始。目前, 对于TIR二级结构的影响作用的研究得较为细致, 而TIR 5'上游序列的二级结构, 以及TIR中不同位置的二级结构对翻译起始的影响, 尚不十分清楚。国内有学者 将一个21bp的序列插入B50中的人PCNA-LacZ融合蛋白mRNA的SD序列的上游11bp HindIII切点处, 构成正、反向插人的两个重组质粒B50i1和B50i2.通过计算机程序对mRNA二级结构的模拟分析,B50i1的插人序列在翻译起始区(TIR)前形成一个发夹结构,但不影响的TIR二级结构。B50i2的插入序列在TIR 5'端形成一个二级结构，而另一克隆D13与B50因SD序列前后的6个和7个碱基序列的不同, 使翻译起始区TIR的SD到AUG附近的二级结构不相同。实验测定的四者的β半乳糖苷酶活性与计算机计算的解开mRNA的二级结构所需能量ΔE进行比较, 其结果说明mRNA TIR前面的二级结构对翻译起始无影响, 而位于TIR的5'端的二级结构对翻译起始效率是有影响的。不过, 它与mRNA TIR的SD到AUG附近的二级结构对翻译起始效率的影响相比，TIR 5'端二级结构的影响比较小。DFTC2023发酵工艺分享大会咨询
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王煜：1882926300
大肠杆菌中蛋白的高效表达需要合适的翻译终止，这样也能保证获得你所想要的东西。在用大肠杆菌表达枯草杆菌FlgM的时候, 有学者发现了分子量大大超过预想的多肽, 其原因是翻译越过了终止密码子UGA。而且他们还发现, 如果在25℃的条件下进行表达就没有此现象了。讨论
尽管对昆虫、酵母、哺乳细胞等真核表达系统的研究现在很热门, 也已取得了一些进展, 但是大肠杆菌仍是目前应用最多最广泛的表达体系。以往的大量实验表明, 已有大量的异源蛋白在大肠杆菌中获得成功表达。不仅如此, 该系统还在分子克隆的基础实验中起着十分重要的作用, 可以毫不夸张地讲, 大肠杆菌表达体系为生物科学的革命性进展作出了不可替代的特殊贡献, 并将继续作为其强大的推动力。然而, 目前蛋白质的表达机制仍未十分明了, 仍然困扰着科学家们。我们依然面临着这样的挑战，如何才能让某种外源蛋白在大肠杆菌中真正高效并完全按照预想的方式表达出来，继续深入研究大肠杆菌表达重组蛋白的生化机制, 彻底弄清其中的每一个生物学事件和相关调控因素将是迎接此挑战的必由之路。这正是本文关注的焦点,也是摆在分子生物学科研工作者面前的现实课题。
