关于益生元和益生菌提高犬初乳免疫功能的研究

摘要

据报道犬初乳中的Ig浓度有很大差异。因此，一些幼犬可能存在被动免疫转移失败的风险。本研究评估了在妊娠期间补充MOS、FOS、屎肠球菌和嗜酸乳杆菌是否能提高初乳质量。20只大丹母犬被分为4组。对照组（CG）仅进行标准饮食的饲喂，其他3个实验组分别在妊娠最后1周(1WG)、最后2周(2WG)和最后4周(4WG)开始在饮食中添加益生元和益生菌，直到分娩。在发情期（T0）、开始给予补充剂的时间（T1）和分娩期（T2）进行血清采样，在剖腹产结束后采集初乳，检测血清和初乳中的IgG、IgM 和IgA。血清中Ig检测结果显示，所有实验组发情期的IgG均高于分娩期，且各组IgG的含量从T0到T1均显著降低。初乳中Ig检测结果显示，4WG组的IgG和IgM均显著升高，而2WG组的IgA已经升高。在4WG组中初乳的IgG、IgM和IgA水平较高，所以在妊娠后4周补充益生元和益生菌可获得最好的免疫特性。确切的机制需进一步的研究验证：产前IgG在乳腺积累和B细胞GALT增殖和乳腺转移。益生元和益生菌对初乳的这些有益作用是否也能改善新生儿幼犬的临床状况和免疫功能，需要进行进一步的研究验证。

关键词：初乳，免疫球蛋白，益生元，益生菌，妊娠，母犬，幼犬

注：益生元：甘露聚糖（MOS）、低聚果糖（FOS）

01

引言

幼犬在刚出生时免疫系统不完善，具备所有功能性结构，但是还未成熟，需要在后期环境的影响下逐渐发展成熟^[1]，建立免疫记忆，达到Th1和Th2之间的免疫应答平衡^[2]。犬胎盘类型属于内皮绒毛膜胎盘，是一种相对不可穿透的屏障，因此初乳的摄入在新生儿免疫系统的成熟和发育过程中起着关键作用^[3]。由于免疫的因素，初乳是被动免疫的一个重要来源^[4]，如IgG、IgA和IgM。IgG从血液聚集到乳腺^[5,6]，IgM和IgA通过肠乳连接聚集到初乳中，浆细胞从肠道相关淋巴组织（GALT）转移到乳腺^[3]。有研究证明，小鼠的浆细胞在派尔斑前体中产生通过血液迁移到乳腺。GALT是B细胞增殖的主要部位，肠道菌群对GALT的发育至关重要，诱导体液免疫反应^[3]。

益生元和益生菌能能以不同的方式与乳腺分泌物的免疫成分相互作用：通过干扰GALT，改变犬的特异性免疫反应的分布和相对丰度；诱导小肠产生更多的分泌型IgA；通过单胃物种的肠乳腺连接免疫，提高乳腺分泌物中的Ig浓度^[7-11]。因此，幼犬可以获得更高水平的免疫球蛋白（Ig）。

有报道称初乳免疫球蛋白中特异性抗体的浓度可能发生变化^[1,12]。初乳中Ig蛋白浓度存在很大的生理性差异，因此一些幼犬可能会因为被动免疫失败或缺乏导致面临死亡的风险^[4]。幼犬可以通过被动免疫使Ig达到最合适的浓度^[4]。本研究在妊娠期犬粮中添加甘露聚糖（MOS）、低聚果糖（FOS）、屎肠球菌和嗜酸乳杆菌，评价其是否能提高母犬血清和初乳中的Ig浓度。

02

材料与方法

行为准则

该研究是按照动物福利委员会的伦理准则进行的，所有程序都是根据意大利动物护理立法（DL 116,27/01/1992）和欧洲动物福利指南（指令2010/63/EU）进行的。整个试验过程均得到了宠物主人的知情同意。根据CESA-DIMEV Bari n. 20/19协议，巴里大学伦理委员会“Aldo Moro”（意大利）对该研究给予了批准。

动物

遵守有关动物健康和福利的严格规定，在FCI（国际犬科动物联合会）认可的犬舍中选择了20只大丹犬（3-6岁；55-68公斤）。在本试验的各个阶段均会报道关于实验动物的健康问题。

幼犬直至长到≥75天才会被出售，在此之前，所有实验动物在整个试验期间被饲养在相同的环境中。根据WSAVA 2015年疫苗接种指南^[13]，母犬定期接种疫苗。每三年接种犬瘟（CDV）、传染性肝炎（CAV）、细小病毒病（CPV2）和副流感病毒（PIV）疫苗，每年接种一次非核心疾病疫苗, 钩端螺旋体和犬窝咳。在试验前的一个月，检查动物对CDV、CPV2和CAV（14）的抗体滴度，并用芬苯达唑驱虫。所有参与研究的母犬报告显示对以上疾病的抗体滴度检测都合格。

为了避免母体疾病对围产期健康的影响，在怀孕前对每只犬进行了临床检查，包括以往病史评估，以及雌性繁殖健康检查（生殖器官的临床和超声评估），结果显示均为健康犬^[15、16]。为了防止并发感染对体液中抗体水平的可能影响而导致的任何偏差，在整个研究过程中我们对所有被筛选的实验动物健康状况进行检查，在所有时间点的检查结果均良好。

03

生育管理

每一窝从发情到分娩的饲养管理都是相似的。使用酶联荧光分析法检测血浆孕酮浓度在4-10ng/mL之间时，确定为排卵日^[17,18]。48小时后实验母犬与已证明有生育能力的雄性交配一次^[19,20]。

根据发情期（排卵后63±1天）的血液孕酮浓度和胎儿生物测定法确定预估的分娩日期^[21,22]。通过胎儿心率评估胎儿健康状况^[23]。对于所有实验母犬，根据母亲和幼犬的健康状况，以及既往病史或预测分娩时的问题，做好剖腹产的计划^[15]。

根据发情时（通过血清血浆孕酮浓度确定排卵期）、妊娠期间（胎儿生物测定）和临产时（血清血浆孕酮浓度下降到2ng/ml以下）获得的匹配信息，选择性进行剖腹产^[15]。

剖腹产时，未预先给药；留置静脉导管，预充氧5分钟，乳酸林格5mL/kg/h静脉输注。麻醉诱导采用阿法沙龙3 mg/kg静脉注射。静脉给予麻醉剂以便气管插管。然后通过制氧机给予2%异氟烷和90-95%氧气的混合气体，维持麻醉效果。打开Mapleson 回路C。在取出最后一只幼犬后给予阿片类药物（肌肉注射美沙酮0.2 mg/kg）和非甾体抗炎药（肌肉注射，美洛昔康0.2 mg/kg）。产下的幼崽在哺乳前进行临床检查并称重。

04

饲喂

所有的母犬都根据妊娠期的代谢需求饲喂相同剂量的商品化粮食，并自由饮水。根据2016年欧洲宠物食品工业联合会（FEDIAF）指南，根据维持能量需求来计算每日食物总摄入量(MER,kcal/die)。根据品种、性格、生理条件和健康状况表示的4k系数，计算每只狗的MER。

本次试验研究筛选20只母犬，每只母犬只考虑怀孕一次。随机分组，分为4组，各组中的实验犬如果年龄和胎次在统计学上的有显著差异将被排除。这种分组技术的目的是为了避免由于年龄和胎次对初乳免疫质量的影响而导致的任何可能的偏差，尽管缺乏关于犬年龄和胎次对初乳质量的影响的数据，但在其他物种中得到相关的描述^[26]。

母犬被分为4组，每组包括5只实验动物。对照组(CG，胎次1-3，年龄3-6岁）只饲喂标准化的商品粮。1WG组，从妊娠后第56天（妊娠最后一周开始，称为1周组，胎次1-3次，年龄4-6岁）开始在饮食中添加益生菌和益生元混合的普通片剂；2WG组，妊娠后第49天（妊娠最后2周开始，称为2周组；胎次1-3,年龄3-6岁）开始在饮食中添加益生菌和益生元混合的普通片剂；4WG组，妊娠最后4周（称为4周组，胎次1-3,年龄3-5岁）开始在饮食中添加益生菌和益生元混合的普通片剂。在所有实验组中，根据排卵日后计算妊娠天数，通过血浆孕酮浓度进行估计，以确定适当给药日期。

商品化补充剂包括：

益生元：低聚果糖40% +甘露聚糖4.05%；

补充剂中益生菌含量为8.86 x 10⁹ CFU/g：屎肠杆菌（DSM 10663/NCIMB 10415 4b1707 ）2.80x 10⁸ CFU/g+嗜酸乳杆菌（CECT 4529 4b1715） 8.58 x10⁹CFU/g。

本补充剂为1.2克的片剂，因此，每片补充剂中含有：FOS 480mg，MOS 48.6mg，屎肠球菌3.36 x 10⁸ CFU，嗜酸乳杆菌1.03 x 10¹⁰CFU。

按照产品说明书，动物每10公斤服用1 片。每只实验犬每天分2次经口给药(上午8点和晚上8点)。

05

样本收集和分析

在监测发情时(T0、基础血清）、开始添加补充剂时（T1）和分娩时（T2） 收集血清样本。用血液采集管从头静脉采集血液，立即离心；然后，分离血清样本，移到空的Eppendorf管中在20C冷冻保存。

在第一次哺乳前，用含有肥皂和洗必泰的抗菌溶液清洗乳腺后，立即收集初乳。通过温和的手工挤奶，分别从母犬每侧第4个和第5个乳头收集样品，分装入不同的4个空的Eppendorf管中。文献报道，不同乳头的初乳中Ig的含量有很大的差异，但尚未发现影响这一现象的因素^[27]。因此，从每只母犬的4个不同乳头中采集初乳，分别测定Ig浓度，并计算每个母犬Ig的平均浓度。

所有样品在-20C下冷冻保存，分析前在室温下解冻。解冻后和分析前，将初乳离心（2000xg，4C下离心30 min）^[27]，分离无酪蛋白无油脂血清进行进一步处理。

基于ELISA双抗夹心原理，采用商业试剂盒(Dog IgG-,IgM-,IgA ELISA,Immunology Consultants Laboratory Inc., Portland,USA) 检测血清和初乳样品中的IgG、IgM和IgA。根据预期的结果^[28]，并按照制造商的说明书指导，样品用ELISA样本稀释液稀释。所有样品均进行重复检测，取两次实验的平均值。样品中含有的Ig（IgG、IgM、IgA）与聚苯乙烯微量滴定板中的各自抗Ig抗体反应。通过洗涤去除未结合的蛋白质。然后，加入与辣根过氧化物酶结合的抗Ig抗体。这种酶标记的抗体与先前结合的Ig（IgG、IgM、IgA）产生复合物。进一步的洗涤后，通过添加显色底物，3,3’,5,5’-四甲基联苯甲胺（TMB）来测定与免疫吸附剂结合的酶。结合酶的含量随Ig（IgG、IgM、IgA）的浓度直接变化。用酶标仪（迈瑞MR96A，深圳迈瑞生物医疗电子有限公司，中国南山） 在450 nm处读取吸光度，测量被测样品中的Ig浓度。样品中Ig（IgG、IgM、IgA）的含量从标准品获得的标准曲线中进行内插值，并根据样品稀释度进行校正。

06

统计分析

所有获得的IgG、IgM和IgA浓度均在Excel 2010 形成文件报告，计算每个参数的平均值±SD。数据的正态分布采用Shapiro-Wilk检验，采用方差分析和重复测量进行统计分析。如果样本组间存在显著性差异，则采用Tukey HSD检验进行比较。

采用方差分析方法对各实验组每窝幼犬数、产仔数、雌雄比例、母犬年龄和胎次进行统计学比较，检验组间是否存在动物学差异。采用方差分析比较4组在T0、T1、T2时血清中IgG、IgM和IgA的浓度，通过重复测量对组间进行比较。最后，采用方差分析方法对4组实验犬初乳中IgG、IgM和IgA 的浓度进行统计学比较。

对于每一个Ig类别，计算变异系数来表达一个母犬不同乳腺的Ig浓度的变异性。得出每只母犬的变异系数，均以百分比表示。然后，计算变异系数的平均值±SD。

计算每个实验组和每一类Ig在初乳中的总百分比，以及各类Ig在初乳中浓度与在基础血清中浓度的比值，以平均值± SD表示，并对4个实验组的进行方差统计学分析。

结果为P<0.05表示具有显著性差异。使用在线工具VassarStats进行统计学分析：

统计学网址

(http://vassarstats.net,Vassar College, New York, NY, USA) 

和社会统计学网址

(https://www.socscistatistics.com,Jeremy  Stangroom, USA)。

07

结果

所有母犬都产下了足月大的幼犬，所有幼犬均为健康犬^[29]，出生体重均在正常范围内^[30]。

4个实验组间，在各组每窝幼犬数（表1）、雌雄比例、产仔数、母犬年龄、胎次等动物学参数上均无统计学差异。

表1  4个实验组间每窝幼犬的数量

注：4个实验组的幼犬平均数无统计学差异。

在母犬血清中，所有实验组中的IgG从T0到T2显著下降(CG: 538.53 ± 169.54 mg/dl vs. 

302.19 ± 128.26; 1WG: 558.78 ± 138.59 vs. 320.40 ± 193.75; 2WG: 519.03 ± 61.06 vs. 318.05 ± 127.44; 4WG: 588.25 ± 55.82 vs. 366.50 ± 184.31)，而IgA和IgM没有变化（表2）。

表2  4个实验组母犬血清中Ig在T0、T1、T2时的浓度

注：T0，交配时间，T1，开始添加补充剂时，T2，分娩时。不同的上标字母表示每个Ig类别之间的统计差异。在任何Ig类别的列内都没有发现有统计学差异。

随着补充剂添加的时间加长，虽然在T2时IgG的浓度有升高的趋势，但是无论在研究的开始（T0），还是在分娩时（T2），4个实验组间母犬血清中Ig浓度（IgG, IgM及IgA）均无统计学差异（表2）。在开始给予补充剂（T1）时，1WG、2WG和4WG之间的Ig血清浓度没有显著差异（表2）。CG组没有关于T1时间点的数据，因为CG组的母犬没有接受任何的补充剂添加，在T0和T2之间的时间段没有取样。

在初乳中，4WG（15.07 ± 1.57 mg/ml）和2WG（15.10 ± 1.33 mg/ml）的IgA显著高于CG（10.84 ± 3.17 mg/ml）和1WG（11.24 ± 2.47 mg/ml，而IgG和IgM只在4WG中明显更集中，IgG为(46.51 ± 17.85 mg/ml ），其余几组IgG为分别为CG 21.06 ± 5.83 mg/ml，1WG 21.90 ± 3.88 mg/ml， 2WG 29.20 ± 18.36 mg/ml；4WG中IgM为1.43 ± 0.09 mg/ml，其余组中IgM分别为 CG 1.21 ± 0.18 mg/ml，1WG 1.23 ± 0.04 mg/ml，2WG 1.23 ± 0.08 mg/ml（表3）。IgG的结果如图1，IgM的结果如图2，IgA的结果如图3。

表3  4个实验组的母犬初乳中Ig的浓度

注：不同的上标表示列内的统计差异。

各实验组中每类Ig与初乳中总免疫球蛋白的比例见表4。4个实验组间对该指标无统计学差异。每类Ig在初乳中的浓度和基础血清中浓度比例见表5。只有4WG的IgG和IgM在初乳中浓度与基础血清浓度的比值显著升高(分别为7.00 ± 1.83 and 1.16 ± 0.20)。在2WG中IgG的比例明显增加但不显著(5.63 ± 3.43)。相反，2WG中IgA在初乳中的浓度和基础血清浓度比值显著升高（2WG，46.88±4.22；4WG，44.15±4.21），1WG也有明显的升高趋势(34.06 ± 5.74)。

表4  各实验组中每类Ig占初乳中总免疫球蛋白的百分比

注：参照对照组，并与已有的文献进行比较，列内无统计学差异。

表5  每类Ig在初乳中的浓度和基础血清中浓度比例

注：参照对照组，并与已有的文献进行比较，不同的上标表示列内的统计学显著差异。

08

讨论

在动物学参数方面，各组间没有任何统计学差异，这具有相关的实验意义，因此可以避免由于胎次和/或母犬年龄而可能导致的系统性偏差^[26]。在本试验中没有提及动物学参数，即母犬的年龄和胎次。然而，两组之间没有任何显著差异，需要统计证明，以避免任何可能的偏差，因为在其他物种中，母性年龄和胎次对初乳组成的影响也有报道，比如猪^{[26, 33]}。         

在本研究中，对照组（CG）初乳中总免疫球蛋白浓度为33.11 mg/ml，高于泌乳第一天的最低阈值（15 mg/ml）^[31]。本次实验在剖腹产结束后第一次哺乳前立即采集初乳样本，以避免任何可能的偏差。曾有人称，在哺乳期刚开始的产奶量很低，但在分娩后的几小时内会大大增加。因此，初乳中免疫球蛋白含量丰富，但随着泌乳增加会逐渐被稀释^[34,35]。乳汁生成量逐渐增加，而在乳腺中积累的IgG则没有增加，因此IgG被更多的乳汁稀释，浓度降低^[27]。此外，所有实验的母犬均是大丹犬，所有的幼犬均是按照相同的计划和手术程序进行剖腹产出生的，所以结果不会受品种和分娩时间的影响。

所有母犬的初乳都达到了令人满意的免疫质量：初乳中IgG浓度始终高于3.4 g/L ^[4]。另一方面，初乳的免疫质量受到补充剂的强烈影响。根据文献报道^{[4,12, 27]}，对照组（CG）的初乳中IgG浓度大约是基础血清的4倍；1WG的补充剂并没有成功地改变这个比例，而2WG和4WG则分别增加了5.5倍和7倍以上，（基础血清IgG浓度见表2，初乳IgG浓度见表3，初乳与基础血清IgG浓度的比值见表5）。

在所有组中，母犬基础血液中IgG的浓度都高于分娩时初乳中的浓度，这与母猪和奶牛的情况相似，证明IgG从血液聚集到乳腺^[5,6]。这一过程应该主要发生在妊娠末期，因为各试验组在T0和T1之间或开始添加补充剂时（T1）的IgG水平没有观察到统计学差异。以前有报道称，人类血清中的IgG通过与乳腺细胞顶端的特定受体FcRn(Fragment constant Receptor neonatal)的连接，从而使IgG集中到乳腺中^[36]。这种生物过程在犬上还未被证明，但我们可以假设存在一个类似的系统。虽然IgG浓度没有观察到统计学意义上的显著差异，但是值得注意的是，在添加补充剂时间较长的实验动物中，T2时血清中的IgG浓度有升高的趋势。可能的机制是益生元和益生菌与免疫系统功能发生协同效应。补充剂添加的时间越长，效果越明显。母体免疫系统会产生较高的水平IgG，但由于怀孕状态，乳腺就会像海绵一样，会不断的尽可能的聚集血液中的IgG。本实验结果证实，初乳中IgG的浓度与补充剂添加的时间长短的关系有统计学意义。此结果最初在2WG组已经被明显证明，但是只有4WG组有统计学意义，平均浓度为46.51 mg/ml，甚至为对照组的两倍多。我们可以假设，只有当血液中IgG水平超过乳腺的过滤和聚集能力时，血清样本中才可以检测到较高的并具有统计学意义的IgG浓度。

除了IgG外，初乳的IgM和IgA也是构成新生儿保护自身的免疫系统的成分之一，穿过肠道上皮细胞，或在肠壁大分子通透性降低后，覆盖在上皮层^[37]。IgM和IgA的保护作用依赖于其特异性：IgM和IgA由母体产生，它们可能对外部抗原具有特异性^[3,38]。根据文献^[12]，结果证实了在所有试验组中，IgA在初乳中的浓度与血清中浓度比率始终最高，在2WG组显著升高（表5）。母体IgM的浓度通常是血清中高于初乳，而只有4WG才显著增加，从而逆转了这一比例（表5）。

本试验的结果显示，4WG组的乳腺分泌物中IgM的浓度增加，母体血液的IgM没有显著增加。有研究显示皮下注射FOS对犬肠道免疫系统有刺激作用^[3,7]。尤其是在没有血液中的IgM通过乳腺上皮细胞过滤到乳腺的情况下，在妊娠第35天开始添加低聚果糖的母犬中，检测到乳腺免疫部位IgM合成率更高^[3]。

另一方面，2WG组成功地提高了初乳中IgA水平。研究了酵母衍生的甘露聚糖（MOS）和低聚果糖（FOS）对犬的影响^{[10, 39, 40]}。研究结果表明，MOS和FOS可以增加粪便中的乳酸菌和双歧杆菌，并使IgA浓度提高到理想浓度^[10,41]。此外，有人认为益生菌（尤其是乳酸菌）可以增强获得性免疫和先天免疫反应，也可以促进IgA的产生。此外，屎肠球菌作用在由于肠道中产生IgA的B细胞的特异性归巢，粘膜致敏的B细胞的优先IgA转换与粘膜IgA反应的增加相关^[44-46]。最后，之前的报道称益生元和益生菌的联合使用可能会对肠道免疫的调节产生累积效应，包括增加IgA的产生^[47]。因此，正如不同作者所建议的，在肠道中启动未成熟的B细胞不仅在肠道固有层中积累，而且在其他器官如乳腺中积累，在乳腺中发育成熟，支持免疫肠-乳腺联系的存在。补充剂添加与持续的时间无关，不影响母体初乳中不同Ig类别的相对丰富度；初乳中单个类别的Ig与总Ig的百分比比较，在组间无统计学差异（表4）。

添加4周的益生元和益生菌可获得初乳的最佳免疫特性，如4WG初乳中较高的IgG、IgM和IgA水平。可能涉及的确切机制需要进一步的研究验证：产前IgG在乳腺的积累和B细胞在GALT增殖和乳腺转移。

最近的一项临床回顾性研究表明，在怀孕期间给母体使用益生元和益生菌会改善幼犬的胃肠道状况^[49]。益生元和益生菌对初乳的这些有益作用是否也能改善新生儿幼犬的临床状况和免疫功能，需要进行进一步的研究验证。

数据有效性声明

支持本实验结果的数据可从通讯作者处获得。

伦理声明

该实验中的动物经CESA-DIMEV Bari n. 20/19审查和批准，同时获得其主人的书面知情同意。

文章来源：Alonge S, Aiudi G G, Lacalandra G M, et al. Pre-and probiotics to increase the immune power of colostrum in dogs[J]. Frontiers in Veterinary Science, 2020: 806.

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