中国制药装备行业发展报告节选

华东理工大学

生物反应器工程国家重点实验室

庄英萍

生物反应器是细胞进行生物反应过程的场所，通过生物反应过程可以生产出人们所需要的各类医药产品 ：抗生素、氨基酸、益生菌等 ；而生物反应器作为细胞生物反应过程的场所，反应器条件（包括反应器设计、反应器操作条件等）会对细胞代谢产生重要的影响，影响生物反应过程的效率。而如何解析生物反应器中复杂生命代谢主体——细胞生理代谢的机理，最终实现生物过程的优化与放大，生产出低成本的各类产品已成为实现高效生物医药制造的关键内涵。

第一，由于生物反应过程是具有生命特征的细胞代谢复杂过程，所以活体细胞在反应器中的生理状态调控是生物反应过程优化与放大的核心，及时获知细胞在反应器环境中的生理代谢特性、设计合理的反应器系统等是生物反应过程优化与放大的前提。

第二，在生物反应过程优化研究中，反应器操作条件的变化会影响细胞内的微观代谢变化，与之相对应的反应器层面宏观代谢情况也会发生变化，因此，为实现生物反应器的优化，必须分别开展细胞微观代谢流、宏观代谢流的研究，进而实现生物反应器内反应过程中微观与宏观代谢流相结合的细胞代谢特性分析，实现生物反应器内菌体细胞微观代谢特性的宏观观测与调控策略，进而实现生物反应过程的强化。

第三，在大型生物反应器中实现反应器的高效放大，其关键在于将优化的小试反应器细胞生理代谢状态在大型反应器中重现，为此，必须开展大型生物反应器的流场特性研究，了解在不同反应器设计、操作条件下的流场变化特性情况，并且与宏观生理特性变化分析相结合，实现流场特性与细胞生理特性研究相结合的生物反应高效过程放大。

细胞在生物反应器中的生命代谢过程是一个复杂的系统过程 ：首先微生物菌种决定了该代谢过程的基本特性，如顶头孢霉菌（Cephalosporium Acremonium）主要的代谢产物是头孢菌素 C（Cephalosporin C）。然而，反应器设计与工艺操作条件的变化，就有可能会改变细胞代谢的特性，发酵过程中的代谢调控策略（培养基配方、补料策略等）的差异，就有可能引起最终目标产物产量的差异 ；而反应器的不同结构会对物质传递造成很大的差异，最终也会导致代谢产物产量的差异。因此，张嗣良等^[1] 提出了微生物反应过程是存在着基因尺度、细胞尺度、反应器尺度等的多输入、多输出的复杂系统，为实现生物过程的优化与放大，就必须实现跨尺度的观察与调控。

（一）研究用生物反应器与过程在线传感器研制与应用

由于生物过程是在生物反应器中进行的，所以，如何在反应器尺度了解细胞在反应器中的生理代谢特性是生物反应过程强化的关键，如大多数的细胞代谢过程是伴随着氧的消耗的，如果对生物反应过程中氧的消耗进行检测，则可了解反应器中细胞的宏观生理代谢特性 ；另一方面，绝大多数的生物代谢过程会产生二氧化碳，同样，若我们能实现过程中二氧化碳浓度变化的检测，也是对细胞宏观生理代谢特性的检测。

1. 研制全参数检测生物反应器

为了全面了解细胞在反应器中的宏观生理代谢特性，张嗣良等^[2] 设计了全面了解细胞生理代谢特性的全参数检测生物反应器。整个装置由生物反应器与计算机数据采集系统二部分组成。生物反应器体积可以是几十升的实验室规模装置，也可以超过 300 吨以上的工业装置。为便于实验室操作和规划，可以选 30L 或 50L 左右的发酵罐体积，由此所得到的试验数据可根据参数调整的放大原理，直接放大到达 300 吨以上的工业发酵罐规模。

在全参数检测的生物反应器中，除了常规检测的温度、DO、pH、转速等，还配置了一些特殊参数的检测 ：检测排气氧和二氧化碳浓度，用于计算整个反应器的氧消耗速率（OUR）、二氧化碳生成速率（CER）；为了计算上述两个生理代谢参数，还配置了准确测定空气流量的质量流量计（工业规模为涡街流量计）、配置了直接安装在反应器顶部的压力变送器、配置了反应器全罐称重系统（工业规模为差压变送器计量体积）和对代谢物质流检测的补料电子秤系统等。

2. 海量数据处理方法

生物反应器在生物反应过程中均配置了计算机数据自动采集系统，对各类过程参数实现在线数据检测与采集，一方面，数据采集与反应器的计算机自动控制形成完整的控制系统，另一方面，大量的数据变为工艺研究人员过程调控的依据也是重要的研究内容。研究团队开发了一个适应多种反应器特点，融合多种过程理论和控制理论，便于发酵过程多尺度工艺分析和优化操作的软件包 BlOSTAR[3]，由此精确得到发酵过程优化与放大所必需的表征生物过程细胞代流特征或工程特征的间接参数，如摄氧率（OUR）、二氧化碳释放率（CER）、呼吸商（RQ）、体积氧传递系数（KLa）、比生长速率（μ）等。

图 2 即为头孢菌素 C 发酵过程，利用 BIRSTAR 软件获得的在线检测参数（包括表征细胞生理代谢特性的 OUR、CER、RQ 以及离线测得的头孢菌素 C 产量等）的实时变化趋势，通过结合生物学知识，对这些参数开展参数相关分析，就有可能实现在反应器尺度或者细胞代谢、甚至基因尺度的变化情况，最后实现过程的优化。

（二）生物反应器内微观代谢特性研究

生物过程中细胞代谢是在细胞内完成的，但是代谢过程中各种代谢物会在胞内、胞外形成一个动态平衡，这些代谢物浓度的变化往往是过程调控中最为重要的内容，然而实际生物反应过程中实时、准确地检测这些浓度又有较大的困难。为此，实现细胞代谢过程胞内微观代谢流研究是非常重要的一个环节。

1. 生物反应过程胞内代谢流研究

任何生物反应过程都是与胞内的代谢途径通量息息相关的。营养物质被利用后通过一系列胞内的代谢途径网络生成目标产物，在此过程中环境因素、微生物胞内的基因组、转录组和蛋白组信息的变化也直接影响着胞内代谢途径的通量。获取发酵过程中细胞微观代谢通量变化信息是了解细胞生理代谢的直接可靠数据，代谢通量分析对生物反应过程强化有着更重要的意义。国内外已有多个研究团队对基于稳定性同位素 13C 的细胞代谢通量的分析原理进行了探讨，但目前国际上常用的 13C代谢流测定方法只适用于处于稳态的连续培养或批培养对数生长期，难以应用到发酵工业上常见的批培养和补料批培养的生产过程，因此，其在工业规模生产过程的应用尚未报道。针对 13C 代谢流测定技术在实际生产应用中碰到的实验成本高、实验周期长等困难，研究团队提出了 ：装置微型化、标记动态化及取样快速化的解决思路，研究批培养和分批培养过程中胞内代谢途径通量的变化，并将胞内微观信息与在线采集的宏观生理状态参数变化相结合分析，较好地解决上述困难并将在工业化研究中得到成功应用。

在具体研究过程中，首先研制了专用的微观代谢流研究装置，采用四罐并行的全参数检测微型反应器（实际反应体积在 150ml 左右，见图 3），可实现平行的将某一条件下完全相同生理状态的反应液放置到不同的反应器，进而采用不同调控策略（如不同的 13C 标记的底物流加策略、或不同的反应器操作策略），而后测定不同的胞内代谢流变化情况。在研制完成专用装置后，快速取样系统也是必须具备的，这样才能确保取到真实的样品 ；后续细胞样品的处理、利用 GC-MS、LC-MS-MS等准确测定重要的胞内代谢物等均是非常重要的工作 [4] ；最后，根据分析所得的数据和细胞代谢基本信息，利用自主研制的软件系统构建出合理的胞内代谢网络。

（三）反应器宏观生理代谢特性研究——多尺度参数相关分析研究^[2]

从发酵过程多尺度系统理论来看，生物反应过程中参数趋势曲线相关有可能是某一尺度的线性或动力学行为，也可能是多尺度系统的结构性突变，因此，仅用常规的单一尺度模式就无法解释过程中发生的许多现象。虽然在生物反应过程中这些过程检测到的大多是环境中的状态或操作量，但可以通过进一步分析，得到反映分子、细胞和反应器工程水平的不同尺度问题的研究，也就是实现跨尺度观察和跨尺度操作。

由于生物反应过程具有多容量性和严重非线性特征，表现在过程测量参数的离散性，这种离散性除了测量技术精度和漂移造成的因素外，主要还是由于细胞代谢对环境因子的高度敏感性和细胞代谢的不可逆性，有时还表现在基因水平的启动和表达的影响，输入的初始条件的极细微的差别会产生结果的巨大变化，表现了系统的多态性和不稳定性，为此，必须开展有关生物学机理现象的认识，才有可能在生物反应过程的强化中取得突破性进展。

参数耦合相关是指生物反应过程中各种直接参数、间接参数以及实验室手工参数随着发酵过程的进行而变化，并且参数间发生某种耦合相关，这种参数相关是生物反应器中物料、能量或信息传递、转换以及平衡或不平衡的结果，其微观因素也许只是发生在基因、细胞或反应器工程水平的某一个尺度上，但最终会在宏观过程中有所反映，这就为研究生物反应器中不同尺度的数据关联分析方法提供了线索。

生物反应过程的参数相关分为理化相关和生物相关两大类 ：

第一类是理化相关，即由于纯粹的物质理化性质变化所引起的参数相关。物理过程可包括物质或能量传递、混合、搅拌转速、通气流量、罐压力等；化学过程则有：传热（加热或冷却）、酸碱加入以及由此形成的物理化学现象等，研究中应区分理化性质变化导致的参数变化，对随时调控操作参数是必要的，理化相关对不同细胞对象具有同一性，不会因为细胞生理活性的变化呈现不同的理化相关特性。

第二类是生物相关，即通过生物细胞的生命活动所引起的参数之间的耦合相关，主要体现为两种方式 ：其一，通过生物细胞生长代谢后引起的培养液物性的变化，进而引起的参数相关 ；其二，通过生物细胞及代谢途径的不同所引起的活性变化 , 直接对控制对象特性发生影响。

基于上述原理，可开展生物反应过程中的各种反应器操作参数、反应器层面细胞宏观生理代谢参数的相关分析，再与生物学机理相结合，寻找到过程优化与放大研究的入手点。

（四）生物反应器流场与生理相结合的放大研究

1. 生物反应器流场特性研究

搅拌形式研究 ：虽然搅拌反应器结构比较简单，但其内部流场的结构却随着搅拌桨结构形式、操作条件的不同而存在很大差异。最早期的生物过程研究中工业生产搅拌生物反应器中采用最多的是径流式搅拌桨 Rushton 的单个或多个组合的搅拌系统，继 Rushton 桨的成功应用之后，又出现了大批径流型搅拌桨在搅拌生物反应器中应用的研究，对这些桨的研究发现 ：径流桨流型的一个共同特点，就是典型的分层结构流型，另外，由于桨叶后方气穴的影响，这种搅拌桨通气情况下功率降低明显，为通气搅拌发酵罐的设计带来了困难。随着这一问题在高黏度发酵液发酵应用中的凸现，工程学家开始开发新型的轴流式搅拌桨形式，轴流桨的流型不存在径流桨的分层，而是轴向射流占主体，进而形成轴向的大循环。这种流型结构将有助于生物反应器内底物的混合和气体的分散，另外还有研究发现两种状态发生转化时轴的扭矩及周功率发生很大波动，这对轴的机械强度也将造成危害。

反应器流场特性研究 ：搅拌反应器内流场特性的研究主要通过实验测定和数值模拟两种方法。早期的流速测定方法有毕托管、电磁流速计、压电探头及热线风速仪等，这些测定方法有一个共同的特点也是影响其在流场测定中发展的一个缺点，即它们都是接触式的，也就是它们在流场中会与流场相互作用从而影响流场使得测得的速度并不能真实还原流场的信息。为了解决这一问题，各种不同的非接触式流场测定技术相继产生，其中多以激光为重要手段获取流场内的详细信息，比较典型的是激光多普勒测速方法和激光粒子成像测速技术，这两种方法都以激光为媒介不需要在流场中插入探头，实现了流场测定的非接触性要求。

由于搅拌反应器的流场具有非稳定性、湍流复杂性及随机性，粒子成像测速仪则可以测定搅拌反应器内整个流场瞬态分布 , 它具有不干扰流场、精度高、空间分辨率高等特点，因而被广泛用于流场特性研究。

在前述基本理论和相关装备的支撑下，华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室过程工程研究团队在众多工业发酵的优化与放大中实施，其中包括抗生素、核苷酸、氨基酸、有机酸、酶制剂等各行业，一方面，通过应用完整的理论、方法与装备，显著提升了原有产品的生产产能（提高 20%-300%）；另一方面，实现了从 50L 反应器到百吨级（最大 370m3）的高效放大，突破了长期来逐级放大的瓶颈，为企业产品生产降低了成本，并取得显著经济效益，因此，研究团队曾四次获得国家科技进步二等奖，详细举例如下。

（一）基于微观与宏观代谢特性相结合的维生素 B12（VB12）发酵优化放大实践

在 VB12 发酵过程研究中，为了对脱氮假单胞菌生产 VB12 的工艺进行深入的优化，详细了解生产菌胞内的代谢网络对于底物的流加控制和工艺控制条件的改优化都非常关键，我们利用优化建立好的以葡萄糖为唯一碳源的全合成培养基工艺，以带 13C 标记的葡萄糖进行发酵培养，同时结合菌体的生理代谢参数对该菌的代谢途径进行了鉴定。

通过研究发现 ：VB12 发酵过程中，发酵进行到 20 小时 DO 就会跌零，而此时的反应体系给予多大的供氧，细胞均会将氧耗竭（DO 为零）；但与此同时，也观察到并不是越大的耗氧对应越大的 VB12 的产量。所以通过开展不同供氧（低、中、高）条件下观察不同操作情况下细胞内微观代谢流的变化，得到如下结论 ：在发酵初始的细胞生长阶段，高供氧有利于菌体的合成；而在发酵后期的产物合成阶段，高供氧则更有利于产物的合成 ；另一方面，发现产物合成阶段过高的 CO2 会抑制VB12 的合成。最后在工业规模 120m3 的发酵过程中形成了阶梯式供氧、后期增加通气量的简单工艺，在工厂全面推广，产量提升 3 倍以上，极大降低了生产成本，同时也大幅度地提升发酵生产效率 ^[5]。

（二）基于流场和生理代谢特性相结合的头孢菌素 C 发酵过程优化放大实践

头孢菌素 C 是头孢类抗生素的重要中间体，主要通过发酵方法获得。工厂在将 50L 反应器内优化的工艺直接应用于 160m3 反应器中出现问题 ：相同工艺条件下小罐中发酵单位可以达到 40000U/ml，而 160m3 生产罐则最高达到 30000U/ml-32000U/ml, 两种反应器内代谢参数具有很大不同，尤其体现在 RQ 值上，发酵 30小时以前两者 RQ 值较为接近，而 30 小时后大罐的 RQ 上升，而小罐的 RQ 值则处于较低水平，这说明大罐利用的碳源在发生迁移。发酵中后期产素阶段（80 小时后）大罐 RQ 值下降而后一直维持在一定值，但同时期两者相比小罐的 RQ 值总要比大罐低，这表明小罐中对油的利用比大罐要充分。对两个罐中发酵液离心发现有明显的油层，说明油的补加在大罐和小罐中都是充分的，另外离心后大罐油层明显要比小罐油层厚，说明大罐中油的混合与利用是工艺放大中的一个问题，这与搅拌设备具有很大的关系。

另外，研究发现头孢菌素 C 合成是一个高耗氧的过程，因而对反应器的供氧能力要求较高，通过比较高耗氧阶段大罐和小罐中溶氧水平发现，小罐可维持 DO水平在 30% 以上，而工业规模的大罐中在 100h 则达到 20% 甚至以下。可见溶氧水平的限制也是工艺放大当中的一个限制。然而，在原大罐中配备的是菌种引进时国外专家提供的四层径流式 Rushton 桨，这种桨功率准数很大，单罐电机功率达到 540kW，要想提高溶氧有很大限制，迫切需要改造现有搅拌系统，实现小罐优化工艺的放大同时降低功率，减少生产成本。研究团队通过 CFD 数值模拟方法比较了两种搅拌桨组合的流场结构，并结合中试实验验证了模拟结果，提出了搅拌桨型改造的思路——即将上层的搅拌桨改成轴流桨，工厂实施后取得了发酵单位达到35000U/ml 以上的成效，相关研究结果发表在文献^[6]。

（三）流场和生理相结合的红霉素工业规模放大

随着我国抗生素发酵企业参与国际市场竞争加剧，以及国际原料药生产向发展中国家转移，规模化生产过程设备趋向设备大型化、高效和自动化。某厂为启动千吨级原料红霉素生产项目，降低生产成本，采用了大吨位发酵罐（370m3）进行生产，因而急需合理的高效节能的工程装备和设计，以及规模化生产过程优化与放大新理论方法。先期工作已经成功将 50L 发酵优化工艺应用于 132m3 发酵罐中，在放大过程中发现 OUR 的控制是过程放大的一个重要因素，因而，对于 372m3 罐首先要考虑供氧能力，同时，补料工艺要求罐内搅拌能够达到较好的轴向混合，尽量减少补料浓度梯度对菌体代谢的影响。基于以上两点对 372m3 发酵罐的流场模拟主要集中在设备供氧及搅拌混合效率上。

研究团队利用 CFD 数值模拟方法对 50L 和 120m3 发酵罐的流场进行了对比研究，并结合两个规模反应器内的代谢曲线相关分析，最终确定以 OUR 恒定作为放大的放大准则，并结合流场模拟结果对 120m3 反应器搅拌桨系统进行改造以满足OUR 恒定的放大需求，从而实现成功放大，企业生产效率大大提升，为企业带来显著的经济效益，相关研究结果发表在文献^[7,8]。

（四）基于细胞代谢流调控的鸟苷发酵过程优化放大实践

鸟苷是重要的核苷酸产品，一方面，它是众多抗病毒药物的重要中间体 ；另一方面，它作为重要的食品增鲜剂——呈味核苷酸二钠的重要原料，鸟苷属生长部分相关型发酵产物。在和企业的合作研发中发现 ：在典型的发酵过程中发酵前期的生长阶段发酵液中基本检测不到鸟苷积累，大约到 12h 后进人稳定期，开始伴随有鸟苷积累，进入高速产苷期，此过程持续到 40h 左右，然后产苷速率下降，糖耗速率增加，糖苷转化率明显下降。但通过对过程的进一步分析，发现在产苷速率下降的同时，糖耗速率增加，与此同时氨水加入速率也同步增长，这或者是有机酸积累时的酸碱平衡 ( 物理过程 )，或者是氨基酸等含氨有机混合物中间体的积累需要氨源 ( 生物过程 )，如果有有机酸或氨基酸等中间化合物积累的话，则 OUR、CER的降低则就可能表示了代谢流的迁移。

采用纸层析法和 HPLC 方法检测了氨基酸的变化情况，发现随着发酵过程的进行确实有丙氨酸等氨基酸的积累，从 40h 左右伴随产苷速率的降低开始出现明显的丙氨酸的积累 ；同时，对鸟苷合成代谢途径中的关键酶活性也进行了检测。从葡萄糖分解代谢和产物鸟苷合成代谢过程的代谢流分析可知 ：葡萄糖分解的代谢流在 EMP、TCA 和 HMP 之间的合理分配成为产物最大生成的前提，要合成鸟苷，则代谢流应主要向 HMP 途径，进而进入嘌呤途径而合成鸟苷 ；而若代谢途径向 EMP途径迁移，则有可能出现积累氨基酸或有机酸的现象。研究表明 ：当发酵进行到40h 后，原来通往 HMP 途径的关键酶（6-磷酸葡萄糖脱氢酶）酶活是明显下降，而通向 EMP 途径的关键酶（磷酸果糖激酶）酶活是明显下降的。

另一方面，又通过对发酵中间代谢产物的测定和耗氧、CO2 的生成等参数为依据，基于质量守恒定律和代谢反应中间代谢物的拟稳态假设，定量研究了枯草芽孢杆菌代谢流分布随时间变化的特征。研究结果表明，在鸟苷发酵过程 40h 左右，存在着从 HMP 途径到 EMP 途径的代谢流迁移，所迁移的碳源主要生成了氨基酸和有机酸。在上述工艺研究基础上，通过调整代谢流在 EMP 和 HMP 之间的分配平衡后，而且确保 OUR 在 40h 左右不再下降，成功地抑制了氨基酸和有机酸的积累 ；另一方面，通过对通向两条途径的代谢流通量计算对照，也可发现采取新策略后，抑制了代谢流的迁移，始终维持产苷速率在较高水平，最终产苷水平较优化前提高 1 倍以上^[9-12]。

（五）基于全局优化的葡萄糖酸钠发酵过程优化

项目突破了传统的酸钠发酵批培养工艺技术，开发了半连续发酵工艺及膜耦合连续发酵工艺技术，创新性地建立了基于生理代谢参数优化控制连续发酵过程优化控制新工艺，使糖酸转化率提升 15.6%，合成速率提升 85%，产能较原工艺提升 4倍以上，节约发酵成本40% 以上；发酵工艺技术进步，使酸钠生产GOD 和 CAT 酶（外资企业诺维信控制）市场价格及高利润快速下降，研究团队又建立了基于过程氧消耗速率为指导的连续流加酶控制新工艺，大幅度提升酶催化速率，并降低 35% 酶消耗量，产能较诺维信工艺提升了 2.4 倍。研究成果成功推广到了工业生产过程中，企业取得显著经济和社会效益。

作为研究者，首先要从工厂的工业制造的实际过程出发，凝练出科学问题（当然前提研究者自身要拥有多学科交叉的知识），然后围绕科学问题开展基础、应用基础的研究，研究人员和企业的合作才可能成功。

作为生物制造工程化技术的开展，一定离不开工艺、工程、装备一体化，因为真正的工厂企业能使用的技术一定是与此三者密不可分的 ；在这其中设备的合理设计和运用是非常重要的，是实验室成果向产业化转化成功的前提。

“产、学、研”合作，特别是与工厂企业的合作中，要求研究人员是一个具有多学科交叉的团队，只有团队协作才有可能取得成功。如我们研究团队就拥有生物学、生理调控、生物工程、机械工程、传感器与仪表、信息与控制等多个领域的研究人员，才有可能形成围绕发酵过程优化的一整套理论、方法和装备，进而在工业规模推广中发挥作用。

在与企业的合作中，一方面，要与企业加强互动 ；另一方面，要注重企业相关技术人员的培训。本研究团队到企业去时，两项工作必做 ：一是与企业人员共同讨论产业化推广中的应用 ；二是要给企业技术人员上课、培训，让他们真正掌握技术核心，所以最后的产业化推广成功一定是校企合作的结果。

参考文献

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